专利名称: |
一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法 |
摘要: |
本发明属于食品安全免疫学检测技术领域,具体涉及一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法。所述试纸包括底板,所述底板上从左到右依次固接有加样垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述硝酸纤维素膜上从左到右依次设置有检测带和参照带;所述检测带由大田软海绵酸‑蛋白质偶联复合物喷射在所述硝酸纤维素膜上干燥后形成;所述参照带由抗小鼠二抗喷射在所述硝酸纤维素膜上,干燥后形成。本发明提供的试纸及检测方法能快速、灵敏地检测出海产样品中的大田软海绵酸的含量水平,适用于大量样本毒素的安全筛查,从而为海产品食用安全提供快速检测试剂。 |
专利类型: |
发明专利 |
国家地区组织代码: |
吉林;22 |
申请人: |
吉林大学 |
发明人: |
卢士英;郑宇;王菡;王洋;李岩松;任洪林;胡盼;柳增善;周玉;曹旗 |
专利状态: |
有效 |
申请日期: |
2019-04-23T00:00:00+0800 |
发布日期: |
2019-07-16T00:00:00+0800 |
申请号: |
CN201910330343.7 |
公开号: |
CN110018145A |
代理机构: |
西安铭泽知识产权代理事务所(普通合伙) |
代理人: |
俞晓明 |
分类号: |
G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21 |
申请人地址: |
130012 吉林省长春市前进大街2699号 |
主权项: |
1.一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸,其特征在于,包括底板(1),所述底板(1)上从左到右依次固接有加样垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4),所述加样垫(2)靠近所述硝酸纤维素膜(3)的一端叠加且固接在所述硝酸纤维素膜(3)一端上,所述吸水垫(4)靠近所述硝酸纤维素膜(3)的一端叠加且固接在所述硝酸纤维素膜(3)的另一端上,所述硝酸纤维素膜(3)上从左到右依次设置有检测带(5)和参照带(6); 所述检测带(5)由大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物喷射在所述硝酸纤维素膜(3)上,干燥后形成;所述参照带(6)由抗小鼠二抗喷射在所述硝酸纤维素膜(3)上,干燥后形成; 所述大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物是将大田软海绵酸与蛋白质偶联后得到的,所述蛋白质为人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA。 2.根据权利要求1所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸,其特征在于,干燥温度为10-37℃。 3.根据权利要求1所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸,其特征在于,所述检测带(5)由大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物喷射在所述硝酸纤维素膜(3)上,干燥后形成,其中大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物浓度为0.4mg/mL,按1μL/cm的量划膜;所述参照带(6)由抗小鼠二抗喷射在所述硝酸纤维素膜(3)上,干燥后形成,其中抗小鼠二抗浓度为0.4mg/mL,按1μL/cm的量划膜。 4.根据权利要求1所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸,其特征在于,所述大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物的制备方法如下: 步骤(1),将大田软海绵酸溶于N-二甲基甲酰胺中,加入预先配置好的0.1mg/μL N-羟基琥珀酰亚胺溶液及N,N-二环已基碳二亚胺溶液,加入ddH2O,旋涡震荡混匀;大田软海绵酸、N-二甲基甲酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N,N-二环已基碳二亚胺、ddH2O的比例为1mg:50μL:1.55μL:2.85μL:45.6μL; 步骤(2),室温25-28℃震荡孵育2-2.5h; 步骤(3),将步骤(2)孵育好的混合液逐滴加入到等体积蛋白溶液中,所述蛋白溶液为人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA溶于0.1M NaHCO3溶液中制备得到的; 步骤(4),室温25-28℃震荡孵育2-2.5h,得到偶联物; 步骤(5),用30kDa的离心超滤管超滤离心步骤(4)得到的偶联物,收集滤液,得到含有偶联复合物的溶液;将偶联复合物溶液用0.01M pH7.4 PBS溶解,得到OA-蛋白质偶联复合物;采用人免疫球蛋白hIgG制备的OA-蛋白质偶联复合物命名为OA-hIgG,采用BSA制备的OA-蛋白质偶联复合物命名为OA-BSA; 或者,将步骤(4)得到的偶联物用截留分子量为10000的透析带在0.01M pH7.4 PBS缓冲液透析24-48h,收集透析袋内透析产物,离心去除不溶性杂质,所得上清液中加入0.01MpH7.4 PBS,得到OA-蛋白质偶联复合物。 5.根据权利要求4所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸,其特征在于,步骤(5)中,含有偶联复合物的溶液或者上清液用0.01M pH7.4 PBS溶解后,按加入蛋白的理论浓度计算使偶联复合物浓度为1mg/mL,最终得到OA-蛋白质偶联复合物。 6.一种利用权利要求3所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸检测样品的方法,其特征在于,包括如下步骤: C1,准备检测样品:将海产品洗净后剪碎,取1g剪碎的样品加1mL提取液匀浆,称重取五分之一份匀浆后的样品,加200μL提取液混匀,超声浸提并离心后,取上清液用0.01M pH7.4PB缓冲液4倍稀释,得到检测样品;当海产品带壳时,则将海产品洗净去壳后再剪碎; C2,上样分析:将C1中检测样品40μL与38μL上样缓冲液和2μL OA特异性抗体标记量子点荧光探针混匀,反应10-15min,将反应液滴加到腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸的加样垫2上,层析20-30min后用蓝光检测仪观察分析,根据检测带5和参照带6荧光强度判断检测结果;检测带5为T线,参照带6为C线; C3,结果判断:当C线、T线均出现两条荧光条带,且条带荧光强度接近,则检测试纸检测的样品毒素含量低于5ng/mL;当C线出现荧光条带,T线没有荧光条带,反应试纸条检测的样品毒素含量高于20ng/mL;当C线出现荧光条带,T线出现较弱的荧光条带,反应试纸条检测的样品毒素含量在5-20ng/mL之间;当C线不显荧光条带,无论T线是否有条带,其结果均无效。 7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述海产品为贝类海产品。 8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,C1中的检测样品是通过如下预处理步骤所得: 将采集的样品洗净去壳,剪碎,将剪碎的样品与提取液按照1g:1mL的比例混合并匀浆,称重取五分之一份匀浆后的样品,加提取液混匀5min,超声浸提5min,10000rpm离心10min,将上清液用pH7.4 PB缓冲液稀释后备用;所述提取液为甲醇与水按照80:20的体积比例混合而成的。 9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述上样缓冲液配方如下:溶质为0.4g/100mL PEG20 000、4.0g/100mL BSA、5.0g/100mL蔗糖、0.1g/100mL Tween-20,溶剂为0.01MpH7.4的PB。 10.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,C2中的OA特异性抗体标记量子点荧光探针制备方法如下:将制备的OA-hIgG作为免疫原,通过常规杂交瘤技术,制备与纯化得到OA特异性抗体,然后采用常规EDC二步法将OA特异性抗体与量子点荧光微球结合,得到OA特异性抗体标记量子点荧光探针。 |
所属类别: |
发明专利 |