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原文传递一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒及其应用

专利名称：	一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒及其应用
摘要：	本发明公开一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒及其应用，将骆驼乳中α‑乳白蛋白、αs1‑酪蛋白作为骆驼乳特征蛋白，牛乳中β‑乳球蛋白、κ酪蛋白作为牛乳特征蛋白。分离纯化骆驼乳特征蛋白后，采用商品化牛乳特征蛋白以及自制骆驼乳特征蛋白制备的多克隆抗体及单克隆抗体能够应用于ELISA检验。试剂盒主要采用间接ELISA方法定性或定量检测驼奶中驼源性α‑乳白蛋白、αs1‑酪蛋白或牛源性β‑乳球蛋白、κ酪蛋白的含量，样品前处理过程简单，骆驼乳样品经反复离心获得乳样后，用稀释液稀释后可直接测定，并且能同时检测大批样品。测定方法准确、快速，便捷，在骆驼乳的掺伪监测领域具有广泛的实用性和开发价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	新疆;65
申请人：	新疆大学
发明人：	杨洁;邓露;李敏婧;王雪;岳海涛;申彤;陈红征
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910223481.5
公开号：	CN110018311A
代理机构：	西安亚信智佳知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	段国刚
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	830046 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市天山区胜利路14号
主权项：	1.一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒，包括包被液、聚苯乙烯微孔板、洗涤液、样品稀释液、一抗、二抗、封闭液、底物显色液和终止液。 2.如权利要求1所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述一抗为自制多克隆抗体或单克隆抗体，分别为牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体或单克隆抗体、骆驼乳α-乳白蛋白多克隆抗体或单克隆抗体、骆驼乳αs1-酪蛋白多克隆抗体或单克隆抗体、牛乳κ-酪蛋白多克隆抗体或单克隆抗体和阴性对照血清，抗原为牛乳β-乳球蛋白、牛乳κ-酪蛋白以及骆驼乳α-乳白蛋白、骆驼乳αs1-酪蛋白，将免疫前所制备的血清作为阴性对照。 3.如权利要求1所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述二抗为生物素标记山羊抗兔IgG或生物素标记鼠抗兔IgG。 4.如权利要求2所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体、骆驼乳α-乳白蛋白多克隆抗体、骆驼乳αs1-酪蛋白多克隆抗体、牛乳κ-酪蛋白多克隆抗体和阴性血清的制备方法：筛选健康新西兰雄性大白兔，以耳缘静脉采血，离心获得阴性血清备用；分别牛乳β-乳球蛋白、牛乳κ-酪蛋白以及自制的骆驼乳α-乳白蛋白、骆驼乳αs1-酪蛋白混合弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂免疫大白兔，以间接ELISA技术检测牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体、骆驼乳α-乳白蛋白多克隆抗体、骆驼乳αs1-酪蛋白多克隆抗体、牛乳κ-酪蛋白多克隆抗体的效价，各蛋白抗体效价至少达到1:20000以上时处死兔子以心脏采血的方法收集血清，纯化，获得多克隆抗体。 5.如权利要求2所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体、骆驼乳α-乳白蛋白单克隆抗体、骆驼乳αs1-酪蛋白单克隆抗体、牛乳κ-酪蛋白单克隆抗体和阴性血清的制备方法：选取约7周龄的雌性Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原为牛乳β-乳球蛋白、牛乳κ-酪蛋白、骆驼乳α-乳白蛋白和骆驼乳αs1-酪蛋白，免疫原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂免疫经超声充分混匀乳化后，皮下多点及腹腔注射免疫小鼠；分离血清采用间接ELISA法测定效价，当血清效价达到1:64000以上，对反应值最高小鼠尾静脉和腹腔分别注射不含佐剂的100μg免疫原进行最后加强免疫；取脾脏制备淋巴细胞诱导细胞融合，采用间接ELISA法筛选与羊、马、驴、骆驼或牛乳无交叉反应且与牛乳β-乳球蛋白或牛乳κ-酪蛋白或骆驼乳α-乳白蛋白或骆驼乳αs1-酪蛋白反应值较高的阳性克隆进一步扩大培养，注射扩大培养后的细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化，获得单克隆抗体，冻干备用。 6.如权利要求4或5任一项所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述自制的骆驼乳α-乳白蛋白、骆驼乳αs1-酪蛋白的提取方法，包括以下步骤：（1）硫酸铵分级沉淀法粗提骆驼乳α-乳白蛋白：取脱脂骆驼乳，调pH至4.3~4.8，3000~12000r/min离心10~60min，反复多次离心，上清液按硫酸铵饱和度70%~100%进行分级沉淀，得到沉淀经脱盐冻干备用；（2）钙离子沉淀法粗提取骆驼乳αs1-酪蛋白：取脱脂骆驼乳，将pH调至10~12，加入钙离子产生沉淀，调pH至6~8，3000~8000r/min离心10~30min，取沉淀溶于3.3mol/L尿素，调pH至4~5，3000~8000r/min离心10~30min，得到沉淀烘干后备用；（3）超滤离心粗分离骆驼乳α-乳白蛋白或骆驼乳αs1-酪蛋白：取脱脂骆驼乳，调pH至4.3~4.8，3000~12000r/min离心10~60min，反复多次离心，得到上清液与沉淀，上清液使用超滤管5000~10000r/min离心20~30min，分离出分子量低于20kDa的蛋白质为骆驼乳α-乳白蛋白，沉淀溶解使用超滤管5000~10000r/min离心20~30min，分离出分子量低于30kDa的蛋白质为骆驼乳αs1-酪蛋白。 7.如权利要求4所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体、骆驼乳α-乳白蛋白多克隆抗体、骆驼乳αs1-酪蛋白多克隆抗体、牛乳κ-酪蛋白多克隆抗体的效价检测，包括以下步骤：（1）包被：向聚苯乙烯微孔板中每孔加入100μL的2μg/mL牛乳β-乳球蛋白稀释液或2μg/mL骆驼乳α-乳白蛋白稀释液或2μg/mL骆驼乳αs1-酪蛋白稀释液或2μg/mL牛乳κ-酪蛋白稀释液，4℃过夜包被或37℃包被2~4h；（2）洗涤：当聚苯乙烯微孔板恢复室温后，每孔加入200~300μL洗涤液，弃去残留液体，重复2~5次；（3）封闭：每孔加入100~200μL封闭液，37℃条件下封闭1~3h；（4）加一抗：按步骤（2）洗涤，每孔加牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体或骆驼乳α-乳白蛋白多克隆抗体或骆驼乳αs1-酪蛋白多克隆抗体或牛乳κ-酪蛋白多克隆抗体或阴性血清100~200μL，37℃孵育1~3h；（5）加酶标二抗：按步骤（2）洗涤后，用稀释液稀释二抗，按体积比计，二抗:稀释液=1:10000，置冰上待用，每孔加梯度稀释后的二抗100~200μL，37℃孵育1~3h；（6）显色：按步骤（2）洗涤后，每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色时间为10min；（7）终止反应：每孔加入50~100μL终止液，终止反应；（8）测定450nm波长下的吸光度值，获得牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体、骆驼乳α-乳白蛋白多克隆抗体、骆驼乳αs1-酪蛋白多克隆抗体、牛乳κ-酪蛋白多克隆抗体效价。 8.如权利要求5所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体、骆驼乳α-乳白蛋白单克隆抗体、骆驼乳αs1-酪蛋白单克隆抗体、牛乳κ-酪蛋白单克隆抗体的效价检测，包括以下步骤：用2μg/mL牛乳β-乳球蛋白或牛乳κ-酪蛋白或骆驼乳α-乳白蛋白或骆驼乳αs1-酪蛋白包被酶标板，50μl/孔，4℃过夜或37℃包被2~4h。倾去包被液，用 PBST洗涤3~5次后，加入0.4%鱼皮明胶封闭，200μL/孔，37℃，1~3h。弃去封闭液，加入 PBST洗涤3~5次后，加入自1000倍母液，浓度为1mg/ml，开始倍比稀释纯化抗体，空白对照为PBS，50~100μl/孔，37℃孵育1~3h。PBST人工洗板3次后，加入1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗，50μl/孔，37℃孵育1~3h。 PBST人工洗板5次后，加入显色底物pNPP，50μl/孔，37℃显色0.5~1h。测定405nm波长下的吸光度值。 9.如权利要求7或8任一项所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述2μg/mL牛乳β-乳球蛋白稀释液或2μg/mL骆驼乳α-乳白蛋白稀释液或2μg/mL骆驼乳αs1-酪蛋白稀释液或2μg/mL牛乳κ-酪蛋白稀释液，是通过牛乳β-乳球蛋白、牛乳κ-酪蛋白标准品及自制骆驼乳α-乳白蛋白、骆驼乳αs1-酪蛋白分别用包被液稀释获得。 10.一种如权利要求1所述检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫检测试剂盒的应用，其特征在于，具体采用以下技术步骤：（1）样品前处理：取鲜乳4 ºC条件下，12000 r/min，离心30 min，去除上层的乳脂和下层沉淀，将得到的乳样进行反复离心后备用，乳样用包被液稀释，按体积比计，乳样:稀释液=1:10，制得样本溶液；（2）用试剂盒检测：向聚苯乙烯微孔板微孔中加入100~200μL由步骤（1）制备的样本溶液，4℃过夜包被或37℃包被2~4h，300μL洗涤液洗涤3~5次，弃去残留液体，每孔加入100μL封闭液，37℃孵育2~4h，300μL洗涤液洗涤3~5次，弃去残留液体，用稀释液稀释多克隆抗体或单克隆抗体，按体积比计，抗体:稀释液=1:2000~1:4000，每孔加入100μL，37℃放置1~3h，300μL 洗涤液洗涤3~5次，弃去残留液体，用稀释液稀释二抗，按体积比计，二抗:稀释液=1:10000，置冰上待用，每孔加稀释后的二抗100μL，37℃孵育1~3h，洗涤3~5次，弃去残留液体，每孔加入TMB 100μL，室温避光显色时间10~30min，每孔加入50~100μL终止液，测定450nm波长处吸光度值；（3）检测结果分析：计算公式为：百分吸光度值(%)＝（B/B0）×100%；公式中B为标准溶液的平均吸光度值，B0为0μg/L标准溶液的平均吸光度值；以牛乳β-乳球蛋白或牛乳κ-酪蛋白或骆驼乳α-乳白蛋白或骆驼乳αs1-酪蛋白浓度为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图；用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应出一个样品的浓度，从标准曲线上读出样品中牛乳β-乳球蛋白或骆驼乳α-乳白蛋白或牛乳κ-酪蛋白或骆驼乳αs1-酪蛋白的浓度。
所属类别：	发明专利