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原文传递一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸条及其应用

专利名称：	一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸条及其应用
摘要：	本发明公开一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸条及其应用，通过制备骆驼乳ɑ‑乳白蛋白金标抗体、骆驼乳αs1‑酪蛋白金标抗体、牛乳β‑乳球蛋白金标抗体以及牛乳κ‑酪蛋白金标抗体，并分别制备检测乳清蛋白组分的试纸条І及检测酪蛋白组分的试纸条Ⅱ，获得一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸条，该试纸条可同时监控乳及乳制品的牛源及驼源蛋白，在骆驼乳的掺伪监测领域具有广泛的实用性和开发价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	新疆;65
申请人：	新疆大学
发明人：	杨洁;邓露;李敏婧;王雪;岳海涛;申彤;陈红征
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910223473.0
公开号：	CN110196330A
代理机构：	西安亚信智佳知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	段国刚
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	830046 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市天山区胜利路14号
主权项：	1.一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸，包括组装成检测乳清蛋白成分的试纸条І和检测酪蛋白成分的试纸条Ⅱ。 2.如权利要求1所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸，其特征在于，所述试纸条І为检测乳清蛋白成分，试纸条І包括：使用牛乳β-乳球蛋白金标抗体及骆驼乳α-乳白蛋白金标抗体混合溶液喷涂的金标垫、使用0.5~1.5mg/mL牛乳β-乳球蛋白的T1液绘制T1线和使用0.5~1.5mg/mL骆驼乳α-乳白蛋白的T2液绘制T2线以及使用0.5~1.5mg/mL羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG的 C液绘制C线的NC膜、样品垫以及吸水垫，进行组装。 3.如权利要求1所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸，其特征在于，所述试纸条Ⅱ为检测酪蛋白成分，试纸条Ⅱ包括：使用牛乳κ-酪蛋白金标抗体及骆驼乳αs1-酪蛋白金标抗体混合溶液喷涂的金标垫、使用0.5~1.5mg/mL牛乳κ-酪蛋白的T1液绘制T1线和使用0.5~1.5mg/mL骆驼乳αs1-酪蛋白的T2液绘制T2线以及使用0.5~1.5mg/mL羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG的 C液绘制C线的NC膜、样品垫以及吸水垫，进行组装。 4.一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸的制备方法，其特征在于，所述免疫胶体金试纸的制备具体过程为：（1）金标垫的制备：将玻璃纤维素膜浸没入封闭液中进行封闭，37 ℃干燥1~2 h，然后牛乳β-乳球蛋白金标抗体及骆驼乳α-乳白蛋白金标抗体混合溶液或牛乳κ-酪蛋白金标抗体及骆驼乳αs1-酪蛋白金标抗体混合溶液喷涂于已封闭好的玻璃纤维素膜上，迅速转移至冷冻干燥机内进行冷冻干燥，制作成为金标垫；（2）样品垫和吸水垫的制备：样品垫为玻璃纤维素膜浸没入封闭液进行封闭，37 ℃干燥备用，吸水垫为吸水性能较好的吸水滤纸材料；（3）NC膜的包被：将制备的C液、T1液及T2液分别在NC膜上划线，从左至右顺序依次为T1液、T2液和C液，置37℃干燥20~40min，干燥后浸没入封闭液封闭，置于37 ℃恒温箱中干燥备用；（4）试纸条的组装：将制备好的样品垫、金标垫、NC膜以及吸水垫裁剪为宽度相同的长方形，并进行重叠组装，分别组装成检测乳清蛋白成分的试纸条І和检测酪蛋白成分的试纸条Ⅱ；（5）步骤（4）所述的重叠组装，从左至右重叠顺序为样品垫右端叠压在金标垫左端上，金标垫右端叠压在NC膜左端上，吸水垫左端叠压在NC膜的右端上，各叠压部分相互交叠1~3cm。 5.如权利要求4所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸的制备方法，其特征在于，所述T1液，用0.01mol/L 磷酸缓冲液将牛乳β-乳球蛋白或牛乳κ-酪蛋白稀释为0.5~1.5mg/mL的溶液。 6.如权利要求4所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸的制备方法，其特征在于，所述T2液，用0.01mol/L 磷酸缓冲液将骆驼乳α-乳白蛋白或骆驼乳αs1-酪蛋白稀释为0.5~1.5mg/mL的溶液。 7.如权利要求4所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸的制备方法，其特征在于，所述C液，用0.01mol/L 磷酸缓冲液将羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG单克隆抗体稀释为0.5~1.5mg/mL的溶液。 8.如权利要求4所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸的制备方法，其特征在于，所述牛乳β-乳球蛋白金标抗体、骆驼乳α-乳白蛋白金标抗体、牛乳κ-酪蛋白金标抗体、骆驼乳αs1-酪蛋白金标抗体的制备具体包括以下步骤：（1）柠檬酸钠还原法制备AuNPs：将氯金酸溶于双蒸水中，使其终浓度为0.1%~0.15%，加热至沸腾，取0.75~1.5mL 1% 柠檬酸三钠溶液加入上述沸腾的锥形瓶中，迅速混合均匀，保持100℃，10~20 min，待溶液冷却至室温后，用双蒸水补充溶液至原体积；（2）金标抗体的制备：将18~36 μg的牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体或牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体或牛乳κ-酪蛋白单克隆抗体或牛乳κ-酪蛋白多克隆抗体或骆驼乳α-乳白蛋白单克隆抗体或骆驼乳α-乳白蛋白多克隆抗体或骆驼乳αs1-酪蛋白单克隆抗体或骆驼乳αs1-酪蛋白多克隆抗体分别加入胶体金溶液中，调节带标记的AuNPs溶液的pH至7.6~8.5，混合并静置2~5min；（3）AuNPs 的质量鉴定：采用扫描电子显微镜观察AuNPs的性状及聚集情况，并使用400~700 nm紫外分光光度计对制备好的AuNPs溶液进行检测，记录结果，AuNPs溶液的最大吸收峰波长与AuNPs平均粒径存在线性关系，可以依据回归方程计算AuNPs的平均粒径：y=0.4271x+514.56，式中：y为胶体金溶液最大吸收峰值，x为金颗粒平均粒径；（4）金标抗体的活性鉴定：取羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG作为二抗，二抗在硝酸纤维膜上点样并做好位置标记，将硝酸纤维膜放置37℃干燥箱中干燥，然后取金标抗体于二抗的位置点样静置，迅速用双蒸水冲洗，将未与二抗反应的金标抗体冲洗掉。 9.如权利要求8所述的一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸的制备方法，其特征在于，所述牛乳β-乳球蛋白、牛乳κ-酪蛋白、骆驼乳α-乳白蛋白、骆驼乳αs1-酪蛋白单克隆抗体的制备具体包括：选取约7周龄的雌性Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原为牛乳β-乳球蛋白、牛乳κ-酪蛋白、骆驼乳α-乳白蛋白和骆驼乳αs1-酪蛋白，免疫原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂免疫经超声充分混匀乳化后，皮下多点及腹腔注射免疫小鼠；分离血清采用间接ELISA法测定效价，当血清效价达到1:64000以上，对反应值最高小鼠尾静脉和腹腔分别注射不含佐剂的100 μg免疫原进行最后加强免疫；取脾脏制备淋巴细胞诱导细胞融合，采用间接ELISA法筛选与羊、马、驴、骆驼或牛乳无交叉反应且与牛乳β-乳球蛋白或牛乳κ-酪蛋白或骆驼乳α-乳白蛋白或骆驼乳αs1-酪蛋白反应值较高的阳性克隆进一步扩大培养，注射扩大培养后的细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化，获得单克隆抗体，冻干备用。 10.如权利要求1或4任一项一种检测骆驼乳中掺伪牛乳的免疫胶体金试纸的应用，具体包括以下步骤：（1）样品处理：液体乳样品无需前处理，乳粉及乳酪样品经溶解即可使用；（2）检测：将免疫胶体金试纸的样品垫部分浸入待检样品溶液中，等待液体扩散至吸水垫后取出，静置10~15min后观察T线及C线的出现情况；（3）检测结果：试纸条中C线出现代表结果有效；试纸条中T1线及T2线未出现代表待检样品中含有相应抗原；试纸条中T1线未出现而T2线出现，说明待检样品中含有牛乳蛋白，不含有骆驼乳蛋白；试纸条中T1线出现而T2线未出现，说明待检样品中含有骆驼乳蛋白，不含有牛乳蛋白；试纸条中T1线及T2线均未出现，说明待检样品中同时含有牛乳及骆驼乳蛋白；试纸条中T1线及T2线均出现，说明检样品中不含牛乳及骆驼乳蛋白试；纸条中C线未出现，代表结果无效。
所属类别：	发明专利