详情

原文传递一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法

专利名称：	一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法
摘要：	本发明公开了一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，属于麸质蛋白的检测技术领域。本发明啤酒中麸质蛋白绝对定量的方法，包括如下步骤：(1)分别提取啤酒中的不溶性麸质蛋白组分F1和可溶性麸质蛋白组分F2；啤酒中的多肽F3(2)将步骤(1)得到的F1和F2进行酶解；F3进行除盐(3)将酶解后的麸质蛋白组分F1，F2和F3分别进行液相‑质谱分析；(4)进行麸质蛋白的鉴定；(5)麸质蛋白的绝对定量。本发明所述方法灵敏度高，可同时检测多种类型的麸质蛋白，精确度高，假阳性结果概率低。
专利类型：	发明专利
申请人：	大连工业大学
发明人：	孙珍;于欣禾;李宪臻
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T15:00:00+0805
申请号：	CN202010117888.2
公开号：	CN111157659A
代理机构：	大连东方专利代理有限责任公司
代理人：	周媛媛;李馨
分类号：	G01N30/06;G01N30/72;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/06;G01N30/72
申请人地址：	116034 辽宁省大连市甘井子区轻工苑1号
主权项：	1.一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)分别提取啤酒中的不溶性麸质蛋白组分F1、可溶性麸质蛋白组分F2以及啤酒中的多肽组分F3； (2)将步骤(1)得到的F1和F2进行酶解，F3进行除盐； (3)将酶解后的麸质蛋白组分F1和F2，以及除盐后的F3分别进行液相-质谱分析； (4)以Sequest HT为搜索引擎，采用Proteome Discoverer软件对液相-质谱分析结果进行检索，通过与Uniprot数据库中的禾本科植物进行比对，完成麸质蛋白的鉴定； (5)麸质蛋白的绝对定量： a)挑选麸质蛋白的标准肽段，所述标准肽段序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示； b)合成步骤a)中的标准肽段； c)将组分F1、组分F2和组分F3分别进行液相-质谱分析； d)将步骤c)得到的数据导入Skyline软件，即可得到麸质肽段的母离子的相对定量值； e)将步骤b)得到的标准肽段分别以不同浓度分别进行液相-质谱分析； f)将步骤e)得到的数据导入Skyline软件，得到每条标准肽段对应的响应值，根据响应值所对应的浓度制作各标准肽段的标准曲线； g)将步骤d)得到的相对定量值带入步骤f)得到的标准曲线，从而得到每种麸质蛋白的绝对定量值。 2.根据权利要求1所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤(1)中啤酒中的不溶性麸质蛋白组分F1、可溶性麸质蛋白组分F2以及啤酒中的多肽组分F3的提取方法包括如下步骤： ①啤酒经过放置、超声处理进行消泡，将消泡后的啤酒加入截留分子质量为3kDa的超滤管中浓缩； ②超滤管外衬管中的溶液，即为啤酒中的多肽组分F3； ③取超滤管内衬管中的溶液，按体积比为1:3～4加入-20℃～-25℃的0.1M醋酸铵甲醇中，于-20℃～-25℃提取反应8h～20h； ④离心、分离沉淀和上清液，沉淀用丙酮清洗3～4次，风干，即得不溶性麸质蛋白组分F1； ⑤步骤③所述上清液加入-20℃的丙酮后，于-20℃～-25℃提取2h～10h，所得沉淀用丙酮清洗3～5次；离心，弃上清，风干，即得可溶性麸质蛋白组分F2。 3.根据权利要求2所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤①中的浓缩采取方式为4000g 4℃～10℃离心40～70min；所述步骤④与步骤⑤所采取的离心条件为8000g 4℃～10℃离心10～20min。 4.根据权利要求2所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤③中的0.1M醋酸铵甲醇还可以是：0.1M醋酸铵50％甲醇水(v：v)溶液、50％异丙醇水(v：v)溶液、80％异丙醇水(v：v)溶液或60％乙醇水(v：v)溶液。 5.根据权利要求1所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤(2)中的F1和F2进行酶解，具体包括如下步骤： ①将F1与F2分别溶于6M盐酸胍10mM～50mM Tris-Hcl(PH＝8.0～8.2)缓冲液中； ②分别将步骤①所得F1和F2装入截留分子质量为10kDa的超滤管中，分别加入100mmol/L二硫苏糖醇至浓度为20mmol/L，混匀后45℃～60℃孵育1h～1.5h后离心弃上清； ③分别加入100mmol/L碘乙酰胺至浓度为20mmol/L，避光反应40～45min后离心弃上清； ④沉淀物分别用10mmol/L的NH4HCO3清洗3～4次，离心弃上清； ⑤按照质量比为1:30～50的比例加入胰蛋白酶或糜蛋白酶，37℃酶解12h～24h；离心，收集外衬管中溶液。 6.根据权利要求5所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤①-④中的离心条件均为14000g，室温，离心20～30min。 7.根据权利要求1所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤(2)中的F3进行除盐的方法为：将组分F3通过固相微萃取柱，即可完成除盐。 8.根据权利要求1所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤(4)中与Uniprot数据库中的禾本科植物进行比对的肽鉴定的假检出率小于1％，肽允许最多有两个漏切位点；鉴定的参数设置如下：前体离子的质量误差设为10ppm，碎片离子的质量误差设为0.02Da；肽段设定范围为6～144个氨基酸；动态修饰设为甲硫氨酸上+15.995Da的氧化修饰，静态修饰设为半胱氨酸上+57.021Da的甲基化修饰，蛋白质N端的乙酰化为+42.011Da。
所属类别：	发明专利