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原文传递脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法

专利名称：	脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法
摘要：	一种脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，属于生化分析领域。利用两种偶联有针对多肽不同抗原决定簇的抗体的免疫亲和磁珠，在一定的脉冲温育条件下，依次对含有杂质的多肽溶液中的多肽杂质进行结合捕获，使之与杂质分离，将磁分离后上清液中的肽类杂质用固相萃取柱进行富集，同时脱盐，洗脱后用于色谱质谱分析。本发明大幅减少结构类似杂质被同时萃取的可能；萃取过程中采用脉冲温育，通过反应温度的变化使结合在抗体上结合力相对较弱的杂质被结合力较强主成分所替代，进一步减少了杂质被同时萃取的可能，使得分离效率更高。分离后的杂质经固相萃取柱浓缩脱盐，冻干、复溶后可用液相色谱质谱对肽类杂质进行定性、定量分析。
专利类型：	发明专利
申请人：	北京科技大学
发明人：	时国庆;于冰儿;毛心怡;王祎凡;弓爱军;李旭琴
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T21:00:00+0805
申请号：	CN201911315460.2
公开号：	CN111044731A
代理机构：	北京市广友专利事务所有限责任公司
代理人：	张仲波
分类号：	G01N33/68;G01N33/577;C07K1/14;G;C;G01;C07;G01N;C07K;G01N33;C07K1;G01N33/68;G01N33/577;C07K1/14
申请人地址：	100083 北京市海淀区学院路30号
主权项：	1.一种脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，其特征在于：利用两种偶联有针对多肽不同抗原决定簇的抗体的免疫亲和磁珠，在一定的脉冲温育条件下，依次对含有杂质的多肽溶液中的多肽进行结合捕获，使之与杂质分离，将磁分离后上清液中的肽类杂质用固相萃取柱进行富集，同时脱盐，洗脱后用于色谱质谱分析。 2.根据权利要求1所述的脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，其特征在于，在含有杂质的多肽溶液与免疫亲和磁珠反应过程中，采用脉冲温育技术，即在免疫磁珠溶液中加入多肽样品后，使溶液温度在温度1温育一段时间，然后使温度上升至温度2温育一段时间，然后将温度降至温度1，重复上述温育周期多次。 3.根据权利要求2所述的脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，其特征在于所述温度1为37℃，温育时间5min，所述温度2为42℃，温育时间为5min，温育过程重复次数为3次。 4.根据权利要求1或权利要求2所述的脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，其特征在于，分别利用识别多肽药物不同抗原决定簇的两种抗体偶联磁珠，制备免疫亲和磁珠I和免疫亲和磁珠II；所述含有杂质的多肽溶液首先与免疫亲和磁珠I经脉冲温育反应一段时间后，将免疫亲和磁珠I与溶液分离，溶液转入容器A备用；在盛有免疫亲和磁珠I的容器中加入解离液使抗体上结合的多肽解离，将解离后的多肽溶液调整pH值后加入免疫亲和磁珠II，脉冲温育反应一段时间后将磁珠与溶液分离，将溶液转入容器B，并与容器A中的溶液合并。 5.根据权利要求4所述的脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，其特征是所述解离液为pH值小于3的甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 6.根据权利要求4所述的脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，其特征在于，所述A、B容器中合并后的溶液经固相萃取方法进行多肽杂质富集，同时脱盐，用洗脱剂洗脱后得到多肽杂质的浓缩溶液。 7.根据权利要求6所述的脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，其特征是所述洗脱剂为60％乙腈水溶液。 8.根据权利要求1或权利要求2所述的脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，其特征在于，所述免疫磁珠具体制备方法如下： 1)洗涤：取100μL羧基化磁珠于离心管中，用500μL偶联缓冲液(50mM MES，pH 6.0，0.01％Triton X-100)，洗涤3次，磁分离后吸弃上清； 2)活化：在冰上用偶联缓冲液配制EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(50mg/mL)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)(50mg/mL)，向磁珠中加入60μL偶联缓冲液、20μL新配的EDC溶液和20μL新配的NHS溶液涡旋混匀，室温下孵育15min，磁分离并吸弃上清，同1)偶联缓冲液洗涤2次； 3)偶联：用偶联缓冲液稀释多肽的单克隆抗体至0.5mg/mL，将200μL抗体溶液加入磁珠中，涡旋混匀后室温下继续颠倒混匀1h； 4)封闭：磁分离后弃上清，加500μL封闭缓冲液TBS(25mM Tris-Cl,130mM NaCl,2.7mMKCl),pH 8,0.01％Triton X-100)室温颠倒混匀30min； 5)保存：加入500μL偶联缓冲液洗涤3次，后加入100μL保存液(TBS，0.01％Triton X-100)混匀，并在4℃冰箱保存。 9.根据权利要求1或权利要求2所述的脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，其特征在于，所述多肽杂质具体分离方法如下， 1)洗涤：各取100μL免疫磁珠I和免疫磁珠II于两个离心管中，加入1mL去离子水洗涤2次，磁分离后弃上清； 2)第一次结合：将1mL样品溶液加入免疫磁珠Ⅰ中，在脉冲温育下反应30min后磁分离，上清转入容器1，多肽-免疫磁珠复合物用1mL去离子水洗涤3次； 3)解离：在多肽-免疫磁珠复合物中加入500μL解离液(pH值小于3的甘氨酸-盐酸缓冲液、临苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)，使多肽-免疫磁珠复合物解离，多肽进入上清液，磁分离，收集上清，再用250μL解离液洗涤磁珠2次，将磁分离后的上清合并在一起；将解离后的免疫磁珠Ⅰ用1mL去离子水洗涤3次，加入100μL TBS，4℃保存以便下一次的使用； 4)调节pH：将收集到的解离后的多肽溶液用Tris-HCl(pH8)将pH调至7； 5)第二次结合：将1mL样品溶液加入免疫磁珠II中，在脉冲温育下反应30min后磁分离，上清转入容器2，多肽-免疫磁珠复合物用1mL去离子水洗涤3次； 6)杂质的收集：将容器1和容器2中的溶液合并在一起即为与主成分多肽分离的肽杂质。 10.根据权利要求1或权利要求2所述的脉冲温育免疫反应分离富集多肽药物中肽类杂质的方法，其特征在于，所述多肽杂质富集具体方法如下：将固相萃取小柱经过乙腈的活化与平衡后，用0.1％的甲酸水溶液进行冲洗；缓慢加入所收集的含有杂质的上清液并加入甲酸使其浓度为0.1％；用0.1％的甲酸水溶液洗去无机盐极性成分，再用60％乙腈水溶液将所需肽杂质洗脱，得到浓缩后的杂质溶液，最后将杂质溶液冷冻干燥。
所属类别：	发明专利