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原文传递一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法

专利名称：	一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法
摘要：	本发明公开了一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，本发明运用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC‑MS/MS)快速同时检测口服双参平肺颗粒后大鼠血浆中芒果苷、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、柚皮苷、甘草苷、隐丹参酮、知母皂苷BII和甘草酸的含量。该方法包括标准品储备液的配制、内标工作液的配制、标准曲线的制备、血浆样品处理和含量测定。本发明提供的方法灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简单快速，符合体内生物样品测定要求，并能应用于双参平肺颗粒口服给药后的药代动力学研究。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京中医药大学
发明人：	范欣生;陈叶青;段金廒;彭国平;朱振华
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-23T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-13T00:00:00+0800
申请号：	CN201910664679.7
公开号：	CN110231424A
代理机构：	南京经纬专利商标代理有限公司
代理人：	杨海军
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	210023 江苏省南京市栖霞区仙林大道138号
主权项：	1.一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)标准品储备液的配制分别精密称取人参皂苷Rg1、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA、芒果苷、知母皂苷BII、柚皮苷、甘草苷、甘草酸各10mg，分别置于10ml容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，并定容至刻度线，分别制得1.00mg/ml标准品储备液； (2)内标工作液的配制精密称取多潘立酮1mg于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容配成0.1mg/mL储备液；精密移取内标储备液适量，用甲醇稀释，配成浓度为0.1μg/mL的内标溶液； (3)标准曲线的制备用大鼠空白血浆，将步骤(1)的各标准品储备液配制成7个终浓度的系列血浆标准曲线样品：人参皂苷Rg1 1.3-650ng/mL；丹酚酸B 5.0-2495ng/mL；隐丹参酮4.5-2250ng/mL；丹参酮IIA 2.0-1000ng/mL；芒果苷4.5-2250ng/mL；知母皂苷BII 5.0-2250ng/mL；柚皮苷5.0-2497.5ng/mL；甘草苷2.5-1252.5ng/mL；甘草酸1.5-751.2ng/mL；分别取各系列血浆标准曲线样品，加入步骤(2)的内标物，并加入甲酸，混匀，加入乙酸乙酯提取，离心，取上清液在离心浓缩仪上挥干，残渣用甲醇复溶，离心，取上清液注入液相色谱串联质谱法中进行分析；以待测物与内标的峰面积之比值(Y)为纵坐标，以待测物浓度(X)为横坐标，采用加权最小二乘法进行回归计算，得各标准曲线，计算权重为1/X2； (4)血浆样品处理：取灌胃双参平肺颗粒的大鼠待测血浆样品，加入步骤(2)的内标物，并加入甲酸，混匀，加入乙酸乙酯提取，离心，取上清液在离心浓缩仪上挥干，残渣用甲醇复溶，离心，取上清液作为血浆测试样品； (5)含量测定：取步骤(4)得到的血浆测试样品进样，采用液相色谱串联质谱法进行分析，记录各待测成分和内标的峰面积，代入步骤(3)制得的回归方程中，检测血浆中芒果苷、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、柚皮苷、甘草苷、隐丹参酮、知母皂苷BII和甘草酸的含量。 2.根据权利要求1所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，步骤(2)的液相条件为：ACQUITYTM UPLC超高效液相色谱系统，ACQUITYTM UPLC BEHC18色谱柱，规格：2.1mm×100mm,填料直径：1.7μm，柱温：35℃；流动相：0.1％甲酸水溶液为A相，乙腈为B相，梯度洗脱：0-1min，10％-30％B；2-7min，30％B-95％B；7-8.2min,95％-10％B，流速为0.4mL/min，进样体积为5μL，检测时间为8min；质谱条件为：XevoTM TQ质谱系统，离子源ESI源，扫描方式为多反应监测MRM方式，毛细管电压3kV，离子源温度150℃，去溶剂气温度550℃。 3.根据权利要求1所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中：内标物为多潘立酮；所述待测血浆样品与甲酸的体积比为10:1；待测血浆样品与乙酸乙酯的体积比为1:5；加入乙酸乙酯提取及残渣复溶方法均为超声法；混匀方式为涡旋，涡旋时间均为30s-2min；离心条件均为转速10000-13000rpm，离心时间10-15min。 4.根据权利要求2所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中质谱检测为多反应监测MRM方式，MRM监测扫描方式为：芒果苷：离子化方式：ESI+，定量离子对423.22→273.10，锥孔电压：30V，碰撞能量：28eV，保留时间(tR)：2.16min；丹参酮IIA：离子化方式：ESI+，定量离子对295.22→277.22，锥孔电压：28V，碰撞能量：20eV，保留时间(tR)：5.82min；人参皂苷Rg1：离子化方式：ESI-，定量离子对845.53→799.49，锥孔电压：80V，碰撞能量：35eV，保留时间(tR)：2.91min；丹酚酸B：离子化方式：ESI-，定量离子对717.28→519.16，锥孔电压：26V，碰撞能量：18eV，保留时间(tR)：3.08min；柚皮苷：离子化方式：ESI-，定量离子对579.29→271.12，锥孔电压：40V，碰撞能量：28eV，保留时间(tR)：2.89min；甘草苷：离子化方式：ESI+，定量离子对419.16→136.94，锥孔电压：28V，碰撞能量：20eV，保留时间(tR)：2.64min；隐丹参酮：离子化方式：ESI+，定量离子对297.16→251.11，锥孔电压：30V，碰撞能量：26eV，保留时间(tR)：5.54min；知母皂苷BII：离子化方式：ESI-，定量离子对919.58→757.51，锥孔电压：85V，碰撞能量：40eV，保留时间(tR)：2.90min；甘草酸：离子化方式：ESI+，定量离子对823.35→453.35，锥孔电压：18V，碰撞能量：30eV，保留时间(tR)：3.91min；内标物为多潘立酮：离子化方式：ESI+，定量离子对426.16→175.09，锥孔电压：75V，碰撞能量：35eV，保留时间(tR)：3.18min。 5.根据权利要求1至4任一项所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，人参皂苷Rg1、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA、芒果苷、知母皂苷BII、柚皮苷、甘草苷、甘草酸各化合物的标准曲线为： 6.根据权利要求1至/5任一项所述的同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，双参平肺颗粒由人参6重量份、丹参10重量份、桑白皮10重量份、地骨皮10重量份、橘红10重量份、知母10重量份、天冬10重量份、甘草5重量份组成，按下述工艺制备成的颗粒剂：取知母饮片，加水提取二次，第一次加水12倍，第二次加水10倍，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏一，备用；取人参、丹参二味饮片，加体积浓度70％乙醇提取二次，第一次为6倍量，第二次为5倍量，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏二，备用；取药渣与桑白皮、地骨皮、橘红、天冬和甘草合并，加水提取二次，第一次加水12倍，第二次加水10倍，每次1.5小时，滤过，滤液合并，减压浓缩得浸膏三；将上述浸膏一、浸膏二和浸膏三合并，混匀，减压浓缩至50℃相对密度1.16-1.28的稠膏，加入糊精及阿斯巴甜，混匀，制成颗粒，干燥，整粒，分装，即得。
所属类别：	发明专利