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原文传递一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法

专利名称：	一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法
摘要：	本发明涉及酶活力检测技术领域，具体涉及一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法。本发明首先提供一种葡萄糖脱氢酶酶促反应的产物NADPH的HPLC检测方法，所述方法采用以硅烷键合相作为固定相的反相色谱柱，流动相由缓冲盐和有机溶剂组成，紫外检测波长为330～350nm，流速为0.8～1.2mL/min；进而提供一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法。本发明检测方法操作简单，灵敏度高，准确性强，不易受到复杂样品中不溶性颗粒及一些色素的影响，且易于标准化操作。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	广东东阳光药业有限公司
发明人：	屈代鑫;张嘉杰;谢文平;张馨月;梁在华;黄小龙;庞嘉颖;麦倩婷
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910118351.5
公开号：	CN110618203A
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	523808 广东省东莞市松山湖北部工业园工业北路1号
主权项：	1.一种NADPH的HPLC检测方法，其特征在于，采用以硅烷键合相作为固定相的反相色谱柱，流动相由缓冲盐和有机溶剂组成，紫外检测波长为330～350nm，流速为0.8～1.2mL/min。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反相色谱柱是C30柱。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓冲盐选自磷酸氢二钠、乙酸钠、和磷酸钠中的一种或几种；有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的一种或几种。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓冲盐pH为5.0～6.0。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂占流动相总体积的百分比为8～12％。 6.一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法，其特征在于，采用HPLC法检测葡萄糖脱氢酶酶促反应的产物NADPH，进而计算出样品中葡萄糖脱氢酶的酶活力，具体包括如下步骤： (1)绘制NADPH峰面积—NADPH浓度的标准曲线； (2)葡萄糖脱氢酶介导的酶促反应的发生；将pH 8.0Tris-HCl缓冲液、葡萄糖溶液和NADP+溶液混合均匀后，加入Tris-HCl缓冲液稀释过的葡萄糖脱氢酶样品，室温反应后，加热煮沸并冷却至室温； (3)HPLC法检测酶促反应的产物NADPH的生成量； (4)根据NADPH的生成量计算出葡萄糖脱氢酶的酶活力。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的HPLC色谱条件为：色谱柱：C30柱(4.6*250mm)；检测波长：340nm；柱温：28℃；流速：1.0ml/min；运行时间：15min；流动相：乙酸钠溶液(pH＝5.5)和甲醇，甲醇占流动相总体积的百分比为10％。 8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的酶活力计算公式为：式中：A：待测液峰面积；K：标准曲线的斜率； C：标准曲线的截距；N：酶的稀释倍数； M：称取的待测酶粉重量；T：反应时间； U固体：固体样品的酶活；U液体：液体样品的酶活； V总体积：反应总体积；V样品体积：样品反应体积。 9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的室温反应时间T为4min。
所属类别：	发明专利