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原文传递一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法

专利名称：	一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法
摘要：	本发明涉及一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，该方法利用目标物赭曲霉素A诱导介孔硅球释放钌联吡啶以及荧光硅量子点与钌联吡啶之间具有荧光能量转移的特点，构建荧光比率型传感器对赭曲霉素A进行检测；其中，所述介孔硅球为适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球，所述适配体的序列为：5’‑GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA‑3'。该检测方法无需对识别OTA的适配体序列进行标记，不仅节约了检测的成本，更避免了因对适配体标记所引起的亲和能力的下降。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	福建中医药大学
发明人：	许惠凤;朱希;余丽双;王丽丽;张诗琪
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201910147148.0
公开号：	CN109884009A
代理机构：	北京中济纬天专利代理有限公司
代理人：	张磊
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	350122 福建省福州市闽侯县上街镇大学城邱阳路1号
主权项：	1.一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：利用目标物赭曲霉素A诱导介孔硅球释放钌联吡啶以及荧光硅量子点与钌联吡啶之间具有荧光能量转移的特点，构建荧光比率型传感器对赭曲霉素A进行检测；其中，所述介孔硅球为适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球，所述适配体的序列为： 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'。 2.根据权利要求1所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤一：制备水溶性硅量子点；步骤二：制备适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球；步骤三：配制不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液；步骤四：绘制荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线并获得荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的线性回归方程：将不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液分别加入到适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球中，在37℃下振荡10-80min后，分别离心，再在离心所得的上清液中，分别加入水溶性硅量子点，且145μL的上清液中加入5μL的水溶性硅量子点；之后利用荧光光度计在400～680nm下对上述加有水溶性硅量子点的上清液进行检测，并分别记录这些上清液在442nm与625nm处的荧光强度，进而获得这两个波长下荧光强度的比值，根据赭曲霉毒素A标准溶液的浓度以及相应的荧光强度比值，绘制出荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线；根据所得的标准曲线，进一步获得荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的线性回归方程；步骤五：待测液检测：将待测液加入到适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球中，在37℃下振荡10-80min；接着离心后，将5μL的水溶性硅量子点加入到145μL离心所得的上清液中，利用荧光光度计在400～680nm下对加有水溶性硅量子点的上清液进行检测，并记录该上清液在442nm与625nm处的荧光强度，获得这两个波长下荧光强度的比值，将该荧光强度的比值代入步骤四所得的线性回归方程中，经计算得待测液的赭曲霉毒素A浓度。 3.根据权利要求2所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：步骤一制备水溶性硅量子点的具体方法为：将柠檬酸三钠、3-氨丙基三乙氧基硅烷分散在充满氮气的蒸馏水，振荡均匀；混合液转移入聚四氟乙烯反应釜中，在170-190℃下密闭加热4-6小时；之后，转入3kDa的透析袋中透析过夜后，定容备用。 4.根据权利要求2所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：步骤二制备适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球的具体方法为： (1)介孔硅球的合成：将四乙氧基硅烷、乙醇、水以及氨水混合，在室温下搅拌2-3小时得到介孔硅球； (2)氨基功能化的介孔硅球的制备：将步骤(1)所得的介孔硅球干燥后分散在乙醇中，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌过夜，离心分离后得到氨基功能化的介孔硅球； (3)配制适配体溶液； (4)适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球的制备：步骤(2)所得的氨基功能化的介孔硅球与钌联吡啶水溶液混合，振荡放置24小时；之后再将配制好的适配体溶液加入体系中，反应4-5小时；接着，混合物用缓冲溶液清洗3-4次后，分散在缓冲溶液中，得到了适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球；其中，所用的缓冲溶液包括10mM Tris-HAc、50mM NaCl以及10mM MgCl2，且pH为7.4。 5.根据权利要求4所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：步骤(3)配制适配体溶液的方法为：把1OD的适配体放入超高速离心机以10000-15000rpm离心5-10min，加入280μL的蒸馏水，充分混匀配成浓度为10μM适配体母液；之后将该适配体母液放入金属恒温加热器中，在90℃下解链5min；拿出，缓慢降至室温，备用；之后用移液枪取20μL 10μM解链后的适配体母液，加入180μL蒸馏水，充分振荡混匀，稀释为1μM适配体溶液，备用；用移液枪移取20μL 1μM适配体溶液，加入180μL20mM Tris-HCl缓冲液，充分振荡混匀，稀释为100nM适配体溶液；其中，所述Tris-HCl缓冲液包括100mM NaCl、5.0mM KCl以及5.0mM MgCl2，且pH为7.4。 6.根据权利要求4所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：步骤(4)中氨基功能化的介孔硅球与钌联吡啶水溶液混合时，所用的钌联吡啶水溶液的浓度为10-30mM。 7.根据权利要求2所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：赭曲霉毒素A标准溶液的浓度分别为：0，0.5，5，10，30，50，100ng/mL。
所属类别：	发明专利