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原文传递一种乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法及其应用

专利名称：	一种乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法及其应用
摘要：	本发明公开了一种乳制品Kappa‑酪蛋白类型的检测方法，特别是牛乳中Kappa酪蛋白类型的检测方法，属于乳制品领域。本发明的检测方法，通过制备待测样品和标准品，利用反相高效液相色谱依次检测标准品和样品，采集色谱图，根据标准品中KCN‑A和KCN‑B的保留时间，确定样品中Kappa‑酪蛋白的类型和含量；洗脱程序为梯度洗脱，流动相A为体积比0.1%三氟乙酸水溶液、流动相B为体积比0.1%三氟乙酸乙腈溶液。该检测方法可准确分析检测牛奶的Kappa‑酪蛋白类型，省时省力；可根据检测结果区分不同变异体基因类型的奶牛，进而实现优化养殖及育种，同时可根据检测结果有针对性的分类开发高品质乳制品。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	四川;51
申请人：	新希望乳业股份有限公司
发明人：	夏忠悦;谭莲英;宋艳梅;范光彩;陈尚来;刘虎传;钱成林;陈龙
专利状态：	有效
申请日期：	2019-10-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201911019354.X
公开号：	CN110618228A
代理机构：	四川力久律师事务所
代理人：	陈明龙
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	610063 四川省成都市锦江区金石路366号新希望中鼎国际2栋18楼3号
主权项：	1.一种乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： S1准备样品和标准品： 101样品准备：如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳则进行脱脂处理，得到样品待处理液；在样品待处理液中加入缓冲溶液一，静置，离心，混匀，室温静置孵育，所述缓冲溶液一使得Kappa-酪蛋白与其他物质分离；取中层液体，得到样品清液；在杨品清液中加入缓冲溶液二和还原剂；混匀，过滤，得到待上机检测的样品液； 102标准品准备：取Kappa-酪蛋白标准品，加入缓冲溶液一，溶解均匀，室温静置孵育，定容，得到标准品清液；加入缓冲溶液二和还原剂；混匀，过滤，得到已知酪蛋白浓度的待上机标准液；所述缓冲溶液一是含有盐酸胍、双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷和磷酸氢二钠的混合水溶液；样品待处理液：缓冲溶液一的体积比为1:2-10；所述缓冲溶液二是盐酸胍水溶液；所述还原剂为二硫苏糖醇水溶液或β-巯基乙醇水溶液； S2色谱检测：采用反相高效液相色谱依次检测标准液和样品液，采集色谱图，确定标准品中Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B保留时间和峰面积，将样品色谱与标准品色谱进行对比分析，确定样品中Kappa-酪蛋白的类型并计算其含量；色谱参数如下：色谱柱：SB-C8 300A 4.6×250mm 5-Micron 或等效柱；采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：体积比0.1%的三氟乙酸-水溶液、流动相B：体积比0.1%的三氟乙酸乙腈溶液；洗脱程序：时间/min 流动相A/% 流动相B/% 流速/mL/min 0 75.7 24.3 0.7 2 71.2 28.8 0.7 17 64.8 35.2 0.7 30 61.8 38.2 0.7 45 75.7 24.3 0.7 50 75.7 24.3 0.7 检测波长：214nm；进样量：50μL ；柱温：40℃。 2.根据权利要求1所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述101样品准备中，所述脱脂处理具体为：将待处理样品预冷至2-4℃，经10000-12000×g 离心力冷冻离心10-15分钟，弃去上层脂肪，得到样品待处理液。 3.根据权利要求1所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液一是含有5-7mol/L盐酸胍、0.08-0.12mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷、4-6mmol/L磷酸氢二钠的混合水溶液。 4.根据权利要求3所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述101样品准备时，样品待处理液：缓冲溶液一的体积比为1:2-4。 5.根据权利要求1所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述102标准品准备时，标准品清液中标准品和缓冲溶液一的重量体积比为30-70mg：10mL。 6.根据权利要求5所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液二为4-5mol/L盐酸胍水溶液，所述还原剂为 8-12%体积比的二硫苏糖醇水溶液或8-12% 体积比的β-巯基乙醇水溶液。 7.根据权利要求6所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述样品清液：缓冲溶液二：还原剂的体积比为100:97-99:3-1。 8.根据权利要求1所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述S1准备样品和标准品中； 101准备样品具体为：如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳样品预冷至2-4℃，再经10000-12000×g离心力冷冻离心10-20分钟，弃去上层脂肪，得中层清液；取中层清液1ml于 10毫升的离心管中，加入2-5ml 缓冲溶液一，混合均匀，在室温下静置反应1-2小时；将样品涡旋混匀，在14000-18000×g 离心力作用下离心10-20分钟；离心后，取下层液体1ml ，放入新的 5ml离心管中，加入970-990 μL缓冲溶液二和 10-30μL 还原剂溶液，涡旋混匀，离心，将离心后液体用0.22μm微孔滤膜过滤于样品瓶中，得到待测样品。 9.根据权利要求1所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述S1准备样品和标准品中； 102标准品准备具体为：称取已知Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B含量的混合标准品30-70mg至10mL容量瓶中，加入缓冲溶液一，溶解均匀，室温静置反应，定容，得到标准品清液；加入缓冲溶液二和还原剂；混匀，微孔滤膜过滤得到Kappa-酪蛋白标准品清液；得到已知酪蛋白浓度的待上机标准溶液。 10.将权利要求1-9任一所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法用于区分奶牛基因类型。
所属类别：	发明专利